一、實驗原理

 

　　紫外-可見分光光度法基于溶液中物質的分子或離子對紫外和可見光譜區輻射能的選擇性吸收。對于蛋白質而言，其內部的酪氨酸和色氨酸殘基中的苯環含有共軛雙鍵，這些基團在275-280nm波長范圍內具有一個強烈的吸收峰。因此，可以通過測量蛋白質溶液在280nm處的吸光度（A），利用朗伯-比爾定律（A=ebc）來計算蛋白質的濃度。其中，A為吸光度，e為摩爾吸光系數，b為光程長度，c為濃度。

 

　　二、實驗材料

 

　　儀器：TU-1901紫外可見分光光度計、石英比色皿（1cm光程）

 

　　試劑：標準蛋白質溶液（如牛血清白蛋白BSA，已知濃度）、待測蛋白質溶液、0.9%NaCl溶液（作為參比溶液）、雙縮脲試劑（用于其他方法時可選擇）、苯酚試劑（用于其他方法時可選擇）

 

　　工具：吸量管、比色管、擦鏡紙等

 

　　三、實驗步驟

 

　　1.儀器準備

 

　　開機預熱：打開紫外分光光度計電源開關，預熱20-30分鐘。

 

　　波長設置：預熱完成后，按GOTOλ鍵，輸入所需的波長（如280nm），按ENTER鍵確認。

 

　　2.參比溶液設置

 

　　清洗比色皿：用擦鏡紙輕輕擦拭比色皿的光滑面，確保其干凈無污漬。

 

　　參比溶液加入：向比色皿中加入適量的0.9%NaCl溶液，輕輕搖勻后放入光度計凹槽中，蓋好蓋子。

 

　　調零：按ZERO鍵進行調零操作，確保儀器讀數準確。

 

　　3.標準曲線繪制

 

　　溶液稀釋：使用吸量管吸取已知濃度的標準蛋白質溶液，加入比色管中，用0.9%NaCl溶液稀釋至不同濃度（如0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL等）。

 

　　吸光度測量：將稀釋后的標準溶液依次加入比色皿中，在280nm波長下測量各溶液的吸光度，并記錄數據。

 

　　繪制標準曲線：以蛋白質濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

 

　　4.待測樣品測定

 

　　樣品準備：將待測蛋白質溶液用0.9%NaCl溶液稀釋至適當濃度。

 

　　吸光度測量：將稀釋后的待測樣品加入比色皿中，在280nm波長下測量其吸光度。

 

　　濃度計算：根據標準曲線，查找或計算待測樣品的蛋白質濃度。

 

　　四、注意事項

 

　　儀器預熱：確保儀器預熱足夠時間，以提高測量精度。

 

　　比色皿清潔：比色皿應保持干凈，避免劃痕和污漬影響測量。

 

　　波長設置：根據實驗需要設置正確的波長，通常為280nm。

 

　　參比溶液：參比溶液應與待測溶液具有相似的物理和化學性質，以減少誤差。

 

　　樣品稀釋：待測樣品應稀釋至適當濃度，以避免吸光度超出儀器測量范圍。